猪肠道干细胞培养类器官体系的建立和应用

一、引言

猪肠道类器官由肠道干细胞增殖分化形成，能模拟肠道生理结构与功能。其培养体系的建立，为研究猪肠道生理病理、疾病建模、药物筛选及营养物质吸收机制提供了有力工具。

二、体系建立

材料准备：选取健康仔猪，准备无钙镁离子 PBS、含 EDTA 的消化液、Matrigel 基质胶、Advanced DMEM/F12 培养基、各类生长因子（如 EGF、Noggin、R-Spondin1）、抗生素等。

肠道组织获取与处理：无菌条件下取出仔猪小肠，用预冷无钙镁 PBS 冲洗，去除内容物。剪成小段后，置于含 EDTA 消化液中，4℃孵育 30-60 分钟，轻柔摇晃。之后用移液器吹打，使隐窝结构脱落，经滤网过滤，收集滤液离心，获取隐窝沉淀。

接种与培养：将隐窝沉淀重悬于 Matrigel 基质胶，迅速种于培养板，37℃孵育 30 分钟使基质胶凝固。随后加入含多种生长因子、抗生素的 Advanced DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱培养。每 2-3 天换液，去除代谢废物，补充营养与生长因子。

三、体系鉴定

形态学观察：利用倒置显微镜定期观察，类器官应呈现出囊性或腺泡状结构，内含空腔，周围有单层或多层细胞环绕。

分子标志物检测：通过免疫荧光染色，检测肠道干细胞标志物（如 Lgr5）、分化细胞标志物（如肠上皮细胞的 E-cadherin、杯状细胞的 Muc2 等）的表达情况。也可提取 RNA，进行 qRT-PCR 分析，验证相关基因表达水平。

四、应用领域

肠道疾病研究：构建感染模型，如感染猪流行性腹泻病毒，研究病毒对肠道类器官的损伤机制、病毒复制过程及细胞病变效应，为开发防治策略奠定基础。通过基因编辑技术，模拟人类遗传性肠道疾病相关基因突变，探究疾病发病机制与潜在治疗靶点。

药物筛选与毒理学评估：将不同药物或化合物添加到类器官培养体系中，观察类器官形态、增殖、代谢等变化，评估药物疗效与毒性，筛选出具有潜在治疗价值的药物，减少动物实验成本与周期。

营养物质吸收机制研究：添加特定营养物质，利用同位素标记追踪等方法，观察营养物质在类器官细胞内的摄取、转运及代谢过程，明晰肠道对营养物质的吸收利用机制，为优化猪饲料配方、提高养殖效益提供理论依据 。