胰腺癌类器官是指利用胰腺瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物，并具有一定的空间结构组织类似物，可以作为疾病模型，用于胰腺癌治疗、诊断和发病机制的研究。以下是胰腺癌类器官的培养方法：

一、所需设备与材料

设备：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器、眼科剪、眼科镊等。

材料：人胰腺癌类器官培养基试剂盒、基质胶（低因子、无酚红）、细胞培养皿、滤筛、离心管、EP管、细胞培养板、金属冰盒等。

二、操作流程

样本准备

将组织放入含有预冷的（2~8°C）组织保存液的取样瓶中（浸没整个组织），4℃条件下从医院或实验室取回。

将取样瓶消毒，取出组织放入培养皿中拍照，并登记大小、颜色、软硬程度、组织类型等信息。

在细胞培养皿里用原代培养缓冲液浸泡组织，并用其清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1~3mm³的组织块，转移至离心管中。

组织消化

向离心管中加入人胰腺癌原代组织消化液（消化液是组织体积的35倍），在37℃条件下进行消化1015分钟（消化过程中随时观察消化情况）。

取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70um以下的细胞簇后，加入3倍体积原代培养缓冲液终止消化，用枪头轻柔吹打至液体变浑浊。

使用滤筛进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到离心管中，于300g、4℃条件下富集离心5分钟后移去上清（清洗一次），添加适量原代培养缓冲液转移到EP管中，重新重悬离心（清洗二次）。

类器官培养

观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板（金属冰盒或冰上操作）。以24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（金属冰盒或冰上操作），将铺好的培养板放入37℃培养箱中10~15分钟成胶。

添加500~750μl人胰腺癌类器官培养基（恢复室温）进行培养。

观察与传代培养

每天观察类器官并拍照，了解初始类器官数量、增殖速度、形态、微生物污染情况等。

当类器官数量不足或体积较小时，需要进行传代培养。

移液器吸去培养基，每孔添加1~2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液，轻柔吹打基质胶，收集在离心管中（24孔板，每5孔为一组），进行吹打，将类器官吹成细胞团（可取样置于显微镜下观察是否吹打成细胞团）。

加类器官传代缓冲液定容至10ml（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置10分钟或-20℃放置5分钟（目的是使基质胶软化），300g、4℃离心5分钟弃上清。

添加适量类器官传代消化液，在超净台内消化23分钟（中间可以吹打12次），添加适量类器官传代培养缓冲液终止消化，300g、4℃离心5分钟弃去上清，添加传代培养缓冲液重悬移入离心管，300g、4℃离心5分钟，弃上清。

添加25倍基质胶重悬（基质胶体积：细胞沉淀体积=25：1），每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中1015分钟，添加500μl750ul人胰腺癌类器官培养基。

类器官冻存与复苏

冻存：添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬。以24孔细胞培养板为例，密度为2个孔冻存1管（500个/ml密度冻存），每管体积1.4ml。冻存方法有两种，一是将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐；二是4℃冰箱放置30分钟，转移至-20℃放置1小时，再移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

复苏：将水浴锅预热至37℃；细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40分钟的超净工作台台面；在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号，从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并不断摇动，使管中液体迅速融化。约12分钟后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。将类器官组织液移入离心管，添加传代培养缓冲液重悬，轻柔吹打混匀，300g、4℃离心5分钟。弃上清，添加适量传代培养缓冲液重悬，将沉淀转移至EP管，300g、4℃离心5分钟，弃去上清。添加25倍基质胶重悬，每孔基质胶铺在细胞培养板中，放置培养箱中1015分钟，添加人胰腺癌类器官培养基。

三、注意事项

所有操作需在无菌环境下进行，使用预冷的移液器以保证基质胶呈匀浆状。

取材时尽量保证无菌取材，提取细胞过程中所用试剂均加双抗及合适浓度的原代抗生素。

尽可能多采集肿瘤细胞含量高的肿瘤组织，并缩短组织样本在空气中暴露的时间，以减少污染概率。

采集的肿瘤组织样本尽快置于装有专用样本保存液的无菌管中，低温（4℃左右）下快速运转至检测单位（尽量保证采样后2~4小时内送到）。

通过以上步骤，可以成功培养出胰腺癌类器官，为胰腺癌的研究和治疗提供有力的工具。