小鼠小肠类器官培养包含取材、隐窝分离、接种培养及换液观察四大主要步骤，以下为详细介绍：

取材

采用颈椎脱臼法处死小鼠，用 75% 酒精浸泡消毒 5-10 分钟，以确保实验环境的无菌性，避免微生物污染对实验结果产生干扰。

在超净工作台内，打开小鼠腹腔，小心分离出小肠，尽量避免损伤肠道组织。

隐窝分离

将取出的小肠置于预冷的 PBS 缓冲液中，轻轻冲洗以去除肠道内的粪便和杂质。随后，将小肠剪成 1 - 2 厘米的小段。

将小肠段转移至含有 0.5 mM EDTA 的 PBS 缓冲液中，在 4℃条件下轻柔振荡孵育 30 - 60 分钟。此过程旨在使 EDTA 与小肠组织中的钙离子结合，从而破坏细胞间的连接，便于后续隐窝的分离。

孵育结束后，用移液器轻轻吹打小肠段，使隐窝从肠壁上脱落下来，随后将悬液通过 70 μm 细胞筛网过滤，以去除未消化的组织块和杂质。将收集到的滤液在 4℃条件下以 1000 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，得到隐窝沉淀。

接种培养

向隐窝沉淀中加入适量预冷的基质胶，轻轻吹打混匀，使隐窝均匀分散在基质胶中。需注意，操作过程应尽量迅速，避免基质胶在室温下过快凝固。

用移液器将含有隐窝的基质胶悬液缓慢滴加到 24 孔细胞培养板中，每孔滴加 50 - 100 μl，确保基质胶均匀铺展在孔底形成一层薄膜。将培养板置于 37℃、5% CO₂培养箱中孵育 30 - 60 分钟，使基质胶充分凝固。

待基质胶凝固后，向每孔中缓慢加入 500 - 800 μl 预温的类器官培养基，注意避免冲散基质胶和隐窝。将培养板放回培养箱中继续培养。

换液观察

在培养过程中，每隔 2 - 3 天进行一次换液。换液时，先将培养板从培养箱中取出，小心吸去孔内的旧培养基，注意避免吸到基质胶和类器官。随后，向每孔中缓慢加入新鲜的类器官培养基，将培养板放回培养箱中继续培养。

定期在倒置显微镜下观察类器官的生长情况，包括类器官的形态、大小、数量以及是否出现分化等特征。记录观察结果，并根据类器官的生长状态调整培养条件和实验方案。