一、实验准备

材料获取：从手术切除或活检样本中获取母细胞瘤组织，要求样本新鲜且尽可能减少离体时间。同时，准备用于共培养的靶细胞，如免疫细胞、成纤维细胞等，确保细胞状态良好且无污染。

试剂与耗材：准备专门的母细胞瘤类器官培养基，包含基础培养基、生长因子（如 EGF、FGF 等）、小分子化合物（如 Y - 27632）以及抗生素等。共培养体系需额外准备适合两种细胞生长的混合培养基。此外，准备基质胶、胰蛋白酶、EDTA、离心管、移液器、细胞培养板、培养皿等耗材，所有试剂和耗材均需保证无菌。

设备调试：超净工作台提前开启紫外灯消毒 30 分钟以上；二氧化碳培养箱调节至 37℃、5% CO₂；离心机设置合适的转速和时间参数。

二、母细胞瘤类器官培养

组织处理：将母细胞瘤组织置于含冰冷 PBS 的培养皿中，仔细去除多余的结缔组织和坏死部分，用眼科剪将组织剪成约 1mm³ 的小块。将组织块转移至离心管，加入含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的消化液，37℃振荡消化 15 - 20 分钟，期间每隔 5 分钟轻柔吹打一次。消化结束后，加入含血清的培养基终止消化，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。

类器官培养：向离心管中加入适量基质胶，轻柔吹打使组织块均匀分散在基质胶中。将基质胶 - 组织混合物接种到 24 孔板中，每孔 50 - 100μl，置于 37℃培养箱中孵育 30 - 60 分钟，待基质胶凝固。缓慢加入母细胞瘤类器官培养基，每孔 500 - 800μl，放回培养箱培养。每 2 - 3 天观察类器官生长情况，并更换新鲜培养基。

三、细胞共培养

靶细胞准备：将准备用于共培养的细胞在合适的培养基中培养至对数生长期。用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度至合适浓度。

共培养体系建立：当母细胞瘤类器官生长至合适大小（一般为培养 3 - 5 天后），小心吸去类器官培养孔中的部分培养基，加入适量含有靶细胞的混合培养基，使靶细胞与类器官共培养。混合培养基的配方需根据两种细胞的营养需求进行优化，确保两种细胞都能正常生长。

培养与观察：将共培养体系置于培养箱中继续培养，每天在显微镜下观察细胞的生长状态、形态变化以及两者之间的相互作用。每 2 - 3 天更换一次混合培养基，注意操作轻柔，避免对类器官和细胞造成损伤。

四、注意事项

无菌操作：整个实验过程需严格遵循无菌操作原则，避免微生物污染导致实验失败。

培养基优化：母细胞瘤类器官和共培养细胞对培养基的营养成分需求不同，需通过预实验优化混合培养基的配方，以满足两者的生长需求。

观察与记录：密切观察类器官和细胞的生长状态，及时记录实验数据和现象，如细胞增殖情况、形态变化、细胞间的相互作用等，以便后续分析。