动物细胞传代培养：技术要点与应用价值

一、引言

动物细胞传代培养是细胞培养技术中的关键环节，它使细胞能够在体外环境中持续增殖和保存，为众多领域的研究和应用提供了稳定的细胞来源。

二、动物细胞传代培养的基本概念

动物细胞传代培养是指将原代培养物（从动物体内取出组织或细胞后进行的首次培养）中的细胞分离出来，转移到新的培养容器中，并补充新鲜培养基，使其继续生长和增殖的过程。这一过程就像是为细胞开辟了新的 “生存空间”，让它们能够在适宜的条件下不断繁衍。

三、传代培养的时机

细胞汇合度判断

当贴壁细胞在培养容器底部生长并相互接触，覆盖面积达到一定程度时，就需要进行传代。一般来说，对于大多数细胞，当汇合度达到 70% - 90% 时是比较合适的传代时机。例如，成纤维细胞在汇合度约 80% 时，细胞之间的接触抑制作用开始增强，此时进行传代可以避免细胞生长受到过度抑制。

对于悬浮细胞，当细胞密度达到一定程度，如细胞浓度为每毫升  - 个细胞（具体因细胞类型而异），并且细胞生长速度开始减缓，培养基营养成分消耗较快，颜色变化明显（如酚红指示剂显示 pH 下降）时，也是传代的信号。

四、传代培养的准备工作

试剂准备

PBS 缓冲液（磷酸盐缓冲液）：用于清洗细胞，去除残留的培养基和细胞代谢产物。其 pH 值通常在 7.2 - 7.4 之间，成分主要包括氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸氢二钠（）和磷酸二氢钾（），能够维持细胞所处环境的渗透压平衡。

胰蛋白酶溶液：这是一种蛋白酶，能够分解细胞间的连接蛋白，使贴壁细胞从培养容器表面脱离。一般使用 0.25% - 0.5% 的胰蛋白酶溶液，其活性和作用时间需要根据细胞类型进行调整。例如，对于一些比较敏感的细胞，如神经细胞，胰蛋白酶的浓度可能要降低，作用时间也要缩短，以免损伤细胞。

新鲜培养基：根据细胞类型选择合适的培养基，如 DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基或 RPMI - 1640 培养基等，并添加适量的胎牛血清（FBS），一般添加 10% - 20%，还可以加入青霉素和链霉素等抗生素，以防止细菌污染。

器材准备

培养容器：如培养瓶或培养皿，新的培养容器需要经过严格的灭菌处理，以保证无菌环境。灭菌方法可以是高压蒸汽灭菌（对于玻璃和金属容器）或环氧乙烷灭菌（对于一些塑料容器）。

移液器和枪头：用于准确地吸取和转移液体。枪头应选择无菌的一次性产品，并且根据吸取液体的体积选择合适量程的移液器。

五、传代培养的操作步骤

贴壁细胞传代

清洗细胞：首先，小心地将旧培养基从培养容器中吸出，然后用预热（37℃）的 PBS 缓冲液轻轻冲洗细胞 2 - 3 次，每次冲洗时让 PBS 缓冲液覆盖细胞表面，静置片刻后再吸出，以彻底清除残留的培养基和代谢废物。

消化细胞：加入适量的胰蛋白酶溶液，使其均匀覆盖细胞表面。将培养容器放入 37℃的培养箱中孵育，密切观察细胞形态变化。一般消化时间在 1 - 5 分钟左右，当看到细胞逐渐变圆、细胞间的连接开始松散并部分细胞开始脱落时，立即加入含有血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的消化作用。血清中含有胰蛋白酶抑制剂，可以防止胰蛋白酶过度消化细胞。

吹散和接种细胞：用移液器轻轻吹打细胞，使细胞分散成均匀的单细胞悬液。按照一定的比例将细胞悬液接种到新的培养容器中，例如，对于生长速度较快的细胞，可以按照 1:3 - 1:5 的比例进行传代；对于生长较慢的细胞，比例可以适当降低，如 1:2。然后加入适量的新鲜培养基，轻轻晃动培养容器使细胞均匀分布，最后将其放回培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代

离心收集细胞：将含有悬浮细胞的培养基转移到离心管中，在相对离心力（RCF）为 100 - 300g 的条件下离心 3 - 5 分钟，使细胞沉淀在离心管底部。

重悬和接种细胞：小心地吸出上清液，然后用新鲜培养基将细胞沉淀轻轻重悬，根据细胞密度和生长情况，将细胞悬液按照合适的比例接种到新的培养容器中，补充新鲜培养基后放回培养箱培养。

六、传代培养过程中的注意事项

无菌操作

整个传代培养过程必须在无菌环境下进行，如在超净工作台中操作。操作人员要穿戴好无菌工作服、帽子和口罩，使用的试剂、器材都要经过严格的灭菌处理。在操作过程中，要注意避免外界微生物的污染，如避免瓶口长时间暴露在空气中，使用酒精灯火焰对瓶口进行消毒等。

细胞损伤的避免

在清洗和消化细胞时，动作要轻柔，避免对细胞造成机械损伤。尤其是在消化贴壁细胞时，要严格控制胰蛋白酶的浓度和作用时间，因为过度消化会导致细胞损伤，影响细胞的活性和后续的生长能力。在吹打细胞时，也要注意力度，防止细胞破裂。

环境条件的维持

传代后的细胞要尽快放回适宜的培养环境中，保持温度在 37℃、CO₂浓度在 5% 左右、湿度合适的培养箱中培养。同时，要定期观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度、培养基的颜色变化等，以便及时发现问题并采取相应的措施。

七、动物细胞传代培养的应用

细胞生物学研究

可以提供大量的细胞用于研究细胞的生长、增殖、分化和凋亡等基本生命过程。例如，通过对传代培养的细胞进行基因表达分析，可以了解细胞在不同生长阶段的基因调控机制；利用传代细胞进行细胞信号传导研究，有助于揭示细胞内外信号的传递途径。

药物研发与筛选

为药物的毒性测试和疗效评估提供了丰富的细胞资源。可以在传代细胞上进行药物的初筛，观察药物对细胞的生长抑制、形态改变、代谢影响等，快速筛选出有潜力的药物候选物，减少对动物实验的依赖，提高药物研发的效率和成本效益。

生物制品生产

是生产生物制品如疫苗、单克隆抗体等的重要手段。例如，通过传代培养动物细胞来生产流感疫苗，能够保证疫苗的产量和质量，满足大规模的疫苗接种需求。

八、结语

动物细胞传代培养技术是现代细胞生物学和生物技术领域不可或缺的工具。通过掌握传代培养的关键技术要点，包括合适的传代时机、精细的操作步骤和严格的注意事项，能够为科研和生产提供高质量的细胞样本，推动相关领域的不断发展。