样本收集

从人类小肠或结肠的新鲜活检组织中收集样本，需在手术后尽快处理，避免长时间冷藏或冷冻，以保证细胞活性。

组织处理

将样本在磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗，去除血液和杂质。使用显微镜解剖组织，分离出小的上皮片段。

细胞分离

使用胶原酶消化组织，得到细胞悬液。通过细胞过滤器过滤，收集上皮细胞。使用红细胞裂解液去除红细胞，得到纯化的上皮细胞。

类器官培养

将上皮细胞与基质胶（BME）混合，置于 24 孔培养板中，形成小的圆顶状细胞团。将培养板倒置，置于 37°C 培养箱中，使基质胶固化。固化后加入类器官扩展培养基进行培养，每 2-3 天更换一次培养基。

机械分裂和传代

在类器官生长到适当大小后，使用机械方法分裂类器官，将其重新悬浮在新鲜的基质胶中，进行传代培养。通过反复传代，扩展类器官培养。

类器官分化

通过更换含有不同诱导因子的培养基，将类器官分化为特定的肠道上皮细胞类型。通过免疫荧光染色和基因表达分析验证分化效果。

类器官冻存和复苏

使用冷冻保存液，将类器官冻存于液氮中。需要使用时，快速复苏冻存的类器官，重新进行培养。

在肠上皮类器官培养过程中，还需要注意以下事项：

组织消化

消化酶的种类、浓度和消化时间需要根据组织来源和细胞类型进行优化，避免消化过度或不足导致细胞损伤或产量降低。

基质胶的使用

基质胶在室温条件下容易凝固，操作时应在冰上进行，并且在与细胞混合时要避免产生气泡，以免影响类器官的形成。

培养基的选择

根据培养的细胞类型和研究目的选择合适的培养基，如 STEMCELL IntestiCult™-SF 类器官生长培养基是一款无血清、无条件培养基的细胞培养基，可用于有效建立和长期维持源自人肠隐窝的类器官。

污染的预防和处理

在培养过程中要严格遵守无菌操作技术，定期观察类器官的生长情况和培养基的状态，及时发现并处理可能出现的细菌、真菌或支原体污染。

类器官的质量控制

包括类器官小球生长活力评估、类器官细胞悬液数量评估、类器官单细胞悬液活力评估以及类器官免疫学标记物的表达评估等。